今天給各位分享蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)的知識(shí)，其中也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能說(shuō)課進(jìn)行解釋，如果能碰巧解決你現(xiàn)在面臨的問(wèn)題，別忘了關(guān)注365暖場(chǎng)活動(dòng)網(wǎng)（http://www.afnyshop07.cn），現(xiàn)在開始吧！

本文目錄一覽：

• 1、人教版高中生物 說(shuō)課稿
• 2、生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者——蛋白質(zhì)這一節(jié)，分兩個(gè)課時(shí)，第一課時(shí)講什么？
• 3、2. 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（2）
• 4、2. 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（4）

人教版高中生物 說(shuō)課稿

生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者――蛋白質(zhì)?說(shuō)課

一、說(shuō)教材

（一）教材地位和作用

《生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者――蛋白質(zhì)》這一課題是在高中生物必修?1?第二章第?2?節(jié)。這部分內(nèi)容不僅是第二章的重點(diǎn)內(nèi)容，也是整本書的重點(diǎn)內(nèi)容之一。它以本章的第?1?節(jié)細(xì)胞中的元素和化合物知識(shí)、生物組織中的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)檢測(cè)知識(shí)為基礎(chǔ)。通過(guò)學(xué)習(xí)，?使學(xué)生明確蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣，在生命活動(dòng)中承擔(dān)著多種多樣的功能，是非常重要的生物大分子。為第?3?節(jié)學(xué)習(xí)遺傳信息的攜帶者――核酸奠定了學(xué)法基礎(chǔ)。

（二）說(shuō)學(xué)習(xí)目標(biāo)

在課程標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)中，與本節(jié)內(nèi)容相對(duì)應(yīng)的條目是?“?概述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能?”?。?“?概述?”?屬于理解水平，要達(dá)成這一目標(biāo)，首先要理解蛋白質(zhì)的基本組成單位?——?氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及由氨基酸形成蛋白質(zhì)的過(guò)程，因此，本節(jié)的知識(shí)目標(biāo)確定為：?“?說(shuō)明氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及氨基酸形成蛋白質(zhì)的過(guò)程?”?、?“?概述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能?”?。?考慮到認(rèn)同生命的物質(zhì)性對(duì)于樹立唯物主義觀點(diǎn)具有重要意義，而本節(jié)內(nèi)容恰好說(shuō)明了生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)的重要方面?——?許多生命活動(dòng)是靠蛋白質(zhì)來(lái)完成的，因此，?在情感態(tài)度價(jià)值觀方面，就確定了?“?認(rèn)同蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者?”?的目標(biāo)。

（三）學(xué)習(xí)重點(diǎn)、難點(diǎn)

學(xué)習(xí)重點(diǎn)：

1?、氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及氨基酸形成蛋白質(zhì)的過(guò)程

2?、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能

學(xué)習(xí)難點(diǎn)：

由于學(xué)生缺乏有關(guān)氨基酸和蛋白質(zhì)的化學(xué)知識(shí)，細(xì)胞的分子組成又是微觀的內(nèi)容，比較抽象，所以在學(xué)習(xí)時(shí)，以下兩個(gè)知識(shí)點(diǎn)確定為學(xué)習(xí)難點(diǎn)

1?、氨基酸形成蛋白質(zhì)的過(guò)程

2?、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)多樣性的原因

二、?說(shuō)教法

1?．支架式教學(xué)法：

（?1?）拾腳手架：使學(xué)生明白氨基酸和蛋白質(zhì)兩個(gè)概念。

（?2?）進(jìn)入情境：提出氨基酸是如何形成蛋白質(zhì)的和?20?種氨基酸能夠形成多少種蛋白質(zhì)兩個(gè)問(wèn)題。

（?3?）獨(dú)立探索：在教師的幫助下，對(duì)課本上的“氨基酸形成蛋白質(zhì)的示意圖”進(jìn)行探索，并將氨基酸、二肽、三肽、多肽、蛋白質(zhì)等幾個(gè)概念排列順序。同時(shí)對(duì)兩個(gè)氨基酸形成二肽的方法提出設(shè)想。

（?4?）協(xié)作學(xué)習(xí)：對(duì)兩個(gè)氨基酸形成二肽的設(shè)想及蛋白質(zhì)的形成過(guò)程進(jìn)行小組協(xié)商、討論。最后達(dá)成一致――通過(guò)脫水縮合形成，并充分地理解了蛋白質(zhì)的形成方式。

（?5?）效果評(píng)價(jià)：通過(guò)學(xué)生個(gè)人和小組對(duì)個(gè)人的評(píng)價(jià)。教師也可以用課內(nèi)練習(xí)和課外對(duì)核酸知識(shí)的自學(xué)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2?、探究教學(xué)法：本課除了利用支架式教學(xué)法之外，還在學(xué)習(xí)氨基酸和蛋白質(zhì)概念時(shí)利用了探究教學(xué)法：（?1?）聯(lián)系生活，創(chuàng)設(shè)情景，提出探索問(wèn)題，（?2?）引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行探究、推理，（?3?）查閱課本，小組討論進(jìn)行驗(yàn)證，（?4?）師生共同歸納總結(jié)探索結(jié)果。

3?、直觀教學(xué)法：通過(guò)實(shí)驗(yàn)、圖片及多媒體輔助教學(xué)軟件，化靜為動(dòng)，化抽象為具體，增強(qiáng)了教學(xué)內(nèi)容的直觀性、啟發(fā)性，使學(xué)生更好地從感性認(rèn)識(shí)上升為理性認(rèn)識(shí)。

三、說(shuō)學(xué)法

教學(xué)是教師與學(xué)生交流的過(guò)程，選擇良好的學(xué)法關(guān)鍵在于找到教法與學(xué)法的結(jié)合點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)教、學(xué)的統(tǒng)一。根據(jù)上面的教學(xué)方法，本課采用了探究學(xué)習(xí)法與接受式學(xué)習(xí)相結(jié)合。

探究學(xué)習(xí)與接受學(xué)習(xí)并不是兩種絕對(duì)對(duì)立的學(xué)習(xí)，二者只是相對(duì)而言的。從按受學(xué)習(xí)到自由或完全獨(dú)立的探究學(xué)習(xí)，其間還存在著接受中有探究、探究中有接受的混合學(xué)習(xí)。而且從教育實(shí)際看，學(xué)生探究能力的形成與發(fā)展是漸進(jìn)式的，而不是突發(fā)式的。因此，本課在學(xué)習(xí)方法上，結(jié)合學(xué)生剛接觸生物學(xué)科不久的事實(shí)，部分實(shí)行了接受式的學(xué)習(xí)。如氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位等知識(shí)方面采取了接受式學(xué)習(xí)，另外在探究式學(xué)習(xí)過(guò)程中，教師也給充分的幫助和指導(dǎo)。

利用問(wèn)題探討創(chuàng)設(shè)問(wèn)題情境

四、教學(xué)?設(shè)計(jì)

五、說(shuō)教學(xué)過(guò)程

學(xué)習(xí)階段

教師組織和引導(dǎo)

學(xué)生活動(dòng)

教學(xué)意圖

回憶、聯(lián)系，明確學(xué)習(xí)目標(biāo)

生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者——蛋白質(zhì)這一節(jié)，分兩個(gè)課時(shí)，第一課時(shí)講什么？

蛋白質(zhì)這一章節(jié)在高中生物里面還是比較重要的

第一課時(shí)：

氨基酸的分類（必需氨基酸和非必需氨基酸）

氨基酸的結(jié)構(gòu)通式

蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（脫水縮合）與多樣性

第二課時(shí)

4. ?相關(guān)肽鏈數(shù)、氨基數(shù)、羧基數(shù)、肽鍵數(shù)、脫水?dāng)?shù)等等的計(jì)算

5. ?蛋白質(zhì)的功能（結(jié)構(gòu)、催化、運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫）

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（2）

說(shuō)明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

第一步：剪碎去血

將樣品放入PBS緩沖溶液中剪碎，倒掉變色的溶液，換入新的PBS，繼續(xù)剪，一遍一遍地重復(fù)，直到PBS溶液不變色為止。比如肝臟組織，洗完后整個(gè)是一個(gè)偏黃色的組織。在這個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)我們需要用剪刀和鑷子剝離血管組織和脂肪組織等，這些組織的存在會(huì)對(duì)我們對(duì)樣品，比如肝臟組織的蛋白質(zhì)類型產(chǎn)生干擾。去血的過(guò)程中同時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。

第二步：稱重

為了稱量更精確，洗滌之后可以用濾紙將樣品吸干，然后再稱重，能比較準(zhǔn)確地知道我們大約使用了多少組織樣品。

第三步：碎裂

碎裂樣品的方法在上一篇推文里有詳細(xì)的介紹，包括液氮研磨、勻漿等機(jī)械破碎，溫差法、壓力法等物理破碎，以及加入變性劑等化學(xué)處理法。通常情況下呢，用液氮研磨就夠了，研磨到完全變成粉狀。但如果用單一的方法破碎效果不好，或者操作起來(lái)工作量太大，也可以進(jìn)行多方法的組合。比如十幾個(gè)或幾十個(gè)樣品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的運(yùn)動(dòng)量估計(jì)也差不多了，累成狗蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)！這時(shí)候可以考慮使用組織破碎儀，一次可以做八個(gè)十個(gè)的，一起震碎，那就輕松多了。

第四步：裂解

破碎以后，加入裂解液，反復(fù)震蕩，讓樣品充分溶解，裂解液的用量通常是

組織重量：裂解液的體積=1：5

也就是說(shuō)，1克組織，通常加入5ml的裂解液。

在裂解時(shí)，眼睛不要只顧著看手機(jī)或者盯著天花板發(fā)呆，要好好觀察樣品的情況，如果發(fā)現(xiàn)仍然有大塊的組織，或者很多絮狀的組織，則說(shuō)明上一步碎裂的工作做得還不夠。這時(shí)可以加入超聲的方法，或者用組織勻漿器進(jìn)一步碎裂，從而保證蛋白提取比較成功。

有哪些裂解液可選呢？

第五步：離心

裂解并震蕩以后，4℃ 12000rpm離心半小時(shí)，然后吸取上清液。

說(shuō)到這里，插一句，以往的經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)小鼠和人的組織樣品，提取效率大約為0.7%，也就是說(shuō)，如果有100mg的組織，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常規(guī)的質(zhì)譜分析，有100-200mg的蛋白就夠了。如果樣品充足，我們可以分成幾份，先提取一部分做實(shí)驗(yàn)試試，整個(gè)流程走下來(lái)沒問(wèn)題的話，再提一部分，這樣也比較保險(xiǎn)，不會(huì)出現(xiàn)全軍覆沒的慘劇。余下的樣本，還可以做做Western驗(yàn)證或者酶活啥的。

如果樣品量特別少，例如小鼠卵巢，一共也就黃豆那么大，這種情況下可不能用液氮研磨，因?yàn)榇蟛糠謽悠范紩?huì)被刮到研缽的壁上，損失很大！可選的方案是：將小鼠卵巢放進(jìn)試管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用組織破碎儀或者超聲破碎，也可以用4%SDS提取（ 95℃，5分鐘）。這種情況就不要弄太多的碎裂步驟了，步驟越少，樣品的損失就越少。

針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞樣品的處理方法有很多，我們來(lái)看看幾種常見的套路：

A． 最簡(jiǎn)單的方法：

把細(xì)胞從培養(yǎng)皿里取出來(lái)，先加入PBS把培養(yǎng)基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培養(yǎng)皿加入400-700μL裂解液。然后用細(xì)胞刮直接刮取培養(yǎng)皿表面，不停地刮，相當(dāng)于是一個(gè)機(jī)械力的破裂，而細(xì)胞表面是最容易進(jìn)行破裂的。刮完后收集裂解液和細(xì)胞樣品到EP管里，然后進(jìn)行冰上裂解。這是最快最直接有效的方法。

B．多組細(xì)胞平行實(shí)驗(yàn)處理方法：

當(dāng)需要處理多組細(xì)胞，而每組細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間有間隔時(shí)，如果希望后續(xù)的分析是平行的，那么可以先分別胰酶消化以后，收集每組細(xì)胞，液氮或者-80℃保存。等各組細(xì)胞都收集好后，加入裂解液，不超過(guò)200W超聲，放在冰上操作。由于不能用SDS（超聲時(shí)會(huì)引起大量的泡泡），這種情況下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超聲一定要在冰上進(jìn)行，因?yàn)闇囟忍貏e高，很容易超過(guò)37℃，循環(huán)周期的時(shí)間通常會(huì)設(shè)定為：5秒超聲，停4-5秒，再5秒超聲，反復(fù)，整個(gè)過(guò)程持續(xù)5分鐘左右。

C．反復(fù)凍融法：

這種方法用得比較少，因?yàn)闅埩舻募?xì)胞殘片還是比較多，我們認(rèn)為提取是不充分的。

D．化學(xué)處理法：

也是非常簡(jiǎn)單粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分鐘即可。

通常情況下，我們要求細(xì)胞量需要達(dá)到1E6的數(shù)量級(jí)。當(dāng)然，有一些新發(fā)展出來(lái)的方法，需要的細(xì)胞量會(huì)非常少，比較南方醫(yī)科大學(xué)田瑞軍老師課題組做過(guò)1000個(gè)細(xì)胞的蛋白提取，但這些新方法對(duì)操作的要求也很高，如果蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)你還是個(gè)新手，沒有足夠的經(jīng)驗(yàn)，直接拿新方法來(lái)做，風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)比較高了。

對(duì)于這類樣品的處理，去石蠟是比較麻煩的事情。在石蠟包埋過(guò)程中，樣品中的蛋白質(zhì)或脂肪會(huì)用福爾馬林或甲醇固定，形成交聯(lián)狀的結(jié)構(gòu)，從中提取蛋白是非常困難的。難歸難，遇到了還是要迎難而上，咱們得想一些合適的辦法把蛋白有效地提取出來(lái)。通過(guò)很多次的摸索和實(shí)踐，以下是比較可行的處理步驟：

第一步： 去石蠟，先用二甲苯室溫浸泡5分鐘，兩次，再換甲醇室溫浸泡5分鐘，兩次。看起來(lái)很簡(jiǎn)單，但整個(gè)過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)混旋。

第二步： 蛋白裂解，因?yàn)榈鞍妆桓栺R林或甲醇固定得非常緊了，有的人會(huì)選擇加入水，讓樣品泡漲，我們更推薦加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白樣品，然后勻漿和超聲。

第三步： 水化之后，加入4%SDS。對(duì)于4%SDS，通常的處理?xiàng)l件是95℃，5分鐘，但對(duì)于石蠟樣品，交聯(lián)特別厲害，所以推薦95℃下處理60分鐘，再冷卻到室溫。

第四步： 離心，參數(shù)為最大相對(duì)離心力16,000 g，離心10分鐘，取上清，就達(dá)到分離的目的了。

石蠟包埋樣品提取的效率通常是，一平方毫米樣品可提取一微克蛋白，大家可以通過(guò)這個(gè)效率值對(duì)樣品中能提取的蛋白進(jìn)行估算。

對(duì)于植物組織樣品，難點(diǎn)就在于細(xì)胞壁及葉綠素的去除。

第一步： 充分再充分地研磨。由于細(xì)胞壁十分強(qiáng)壯，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的勻漿根本搞不定細(xì)胞壁，沒辦法碎得充分。

第二步： 去色素?？梢酝ㄟ^(guò)有機(jī)溶劑多次反復(fù)沉淀樣品來(lái)去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的樣品，這樣可以把葉綠素去掉。

第三步， 離心取沉淀，然后加入裂解液，讓蛋白充分地溶解。

第四步： 進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提。在抽提的過(guò)程中，要看細(xì)胞的破碎程度或者樣品的類型，葉片樣品相對(duì)來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單，莖的樣品比較麻煩，它的纖維組織比較大，再加上植物細(xì)胞壁又比較厚，所以我們得用超聲、震蕩，以及各種方法組合，進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提。

第五步： 離心取上清，就得到了蛋白溶液。

根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，像葉片這類的樣品，處理起來(lái)比較簡(jiǎn)單，例如水稻的葉片組織提取出來(lái)可以做到8000多個(gè)蛋白蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)；根的樣品稍微麻煩一點(diǎn)，因?yàn)楹刻貏e多，先得烘干，盡量去掉它的水份，干燥后再進(jìn)行研磨提取。否則，我們可能會(huì)加入很多根，但其實(shí)能提取的樣品并沒有多少?；ǖ慕M織，比如桃花、梨花，也是水分太多的問(wèn)題，需要先干燥。種子組織，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有機(jī)溶劑去掉它的脂肪。

總之，根、莖、葉、果實(shí)等，根據(jù)不同的樣品類型，我們需要根據(jù)它的特點(diǎn)設(shè)計(jì)不用的處理步驟，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是通過(guò)有機(jī)試劑去掉它的色素和脂肪組織，水分太多的先烘干再提取，常規(guī)情況就是研磨和去色素。大家清楚了各種處理的用處之后，就可以針對(duì)自己的樣品靈活地處理了。比如棉花樣品，因?yàn)樗w維特別多，你可能就會(huì)想到得通過(guò)研磨和反復(fù)沉淀來(lái)進(jìn)行純化，再進(jìn)行后續(xù)分析。

與植物樣品類似，細(xì)菌樣品的細(xì)胞壁也是我們提取蛋白的最大障礙，尤其是像革蘭氏陽(yáng)性菌，以及一些細(xì)菌的亞型，細(xì)胞壁特別厚，破碎的時(shí)候需要更強(qiáng)的參數(shù)，更長(zhǎng)的時(shí)間。

劉曉慧老師分享了兩個(gè)她遇到的例子：有一次做細(xì)菌樣品，不巧它就是一個(gè)細(xì)胞壁特別厚的亞類，最開始采用急熱驟冷，即從-80℃冰箱取出，95℃煮1分鐘，反復(fù)幾次，然后超聲，但是提出來(lái)的蛋白量特別少。最后還是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，對(duì)于細(xì)菌的樣品，我們可以嘗試多種方法，測(cè)試一下。

還有一次做酵母樣品，在做超聲的時(shí)候，因?yàn)橛悬c(diǎn)事情離開了，所以超聲的時(shí)間就特別長(zhǎng)，并且?guī)状纬曋g做了急熱驟冷處理。另一位同事使用同樣的方法，只是超聲時(shí)間比較短。最后發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間長(zhǎng)的樣品，破碎地非常好，顯微鏡下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超聲時(shí)間短的提取到的蛋白就少很多。所以我們?cè)谒榱褬悠窌r(shí)，也可以多嘗試幾種方法，幾種參數(shù)。

體液樣品難點(diǎn)在于高豐度蛋白的去除。以血清為例，前14種高豐度蛋白占血清總蛋白的95%以上。而質(zhì)譜是一種離子飽和性檢測(cè)器，低豐度離子的信號(hào)很容易被高豐度的抑制，從而無(wú)法檢測(cè)到。

我們有很多辦法去掉高豐度蛋白。當(dāng)然，有些情況下，為了保證樣品的完整性，也有人不去除高豐度蛋白，這個(gè)視具體情況而定。另外，高豐度蛋白可能還會(huì)與一些低豐度蛋白相結(jié)合，當(dāng)我們?nèi)サ舾哓S度蛋白時(shí)，往往就會(huì)將這些有意義的低豐度蛋白也去掉，無(wú)法保證分析的完整性。針對(duì)這種情況，用普通的shotgun方法是很難解決的，后面我們會(huì)介紹一種方法，它在高豐度蛋白存在的情況下，仍然可以穩(wěn)定地可重復(fù)地鑒定到很多中低豐度的蛋白。

要去除高豐度蛋白，很多商業(yè)試劑盒都可以幫到我們。它們的原理各有不同，我們來(lái)看幾個(gè)比較常用的。

第一種是Bio-Rad的Proteominer試劑盒。

這類試劑盒的原理是：通過(guò)一個(gè)六肽配基與高豐度蛋白結(jié)合，從而進(jìn)行去除。這種方法是非抗體型的，沒啥特異性，它不受物種限制和樣品類型限制。當(dāng)樣品進(jìn)來(lái)時(shí)，六肽配基會(huì)優(yōu)先結(jié)合豐度高的蛋白質(zhì)，豐度低的嘛，結(jié)合的機(jī)會(huì)小很多，于是就達(dá)到了分離去除的目的。

通過(guò)這個(gè)辦法處理后，最終能鑒定到的蛋白也是比較多的，從鑒定的數(shù)量上看，與安捷倫的特異性試劑盒差不多。但如果要發(fā)高分的文章，用這種方法容易受到質(zhì)疑，也是因?yàn)樗奶禺愋圆粡?qiáng)，去高豐度有一定的隨機(jī)性，高分雜志不太接受這種隨機(jī)的方法。但如果你的樣品體積特別大，可以先試著用Proteominer做一次，接下來(lái)再使用一些特異性的去高豐度蛋白的方法?；蛘吣愕臉悠窙]有特異性抗體柱可以用的話，也可以考慮這種方法。

第二種是安捷倫的MARS柱。它含有14種蛋白抗體，針對(duì)血清中的高豐度蛋白能很有針對(duì)性地去除，需要的樣品量通常為20μL-40μL，20μL的血清樣品可以得到約100微克的蛋白樣品，40μL的量足夠我們做一次iTRAQ或label free實(shí)驗(yàn)了。

第三種試劑盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的試劑盒，可以去兩個(gè)高豐度蛋白?，F(xiàn)在出了一個(gè)去20個(gè)高豐度蛋白的試劑盒，這是基于抗體方法，針對(duì)性很強(qiáng)，是比較公認(rèn)的方法。

第四種是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，里面用到這個(gè)試劑盒，先是用特異性柱子去掉14個(gè)高豐度蛋白，然后再特異性去掉50個(gè)中豐度的蛋白，最后可以鑒定到5300多個(gè)血清蛋白質(zhì)。對(duì)比現(xiàn)在常規(guī)的方法，通常只能鑒定到500-600個(gè)血清蛋白，如果高豐度蛋白去除得比較好，用QE的方法做，也只能鑒定到1000個(gè)左右蛋白。這篇文章鑒定出了5300個(gè)蛋白質(zhì)，在血清樣品的蛋白鑒定中確實(shí)是一個(gè)相當(dāng)outstanding的結(jié)果了。

以上是四種比較常用的去高豐度的試用盒。總的來(lái)說(shuō)，針對(duì)像尿液這類體積很大的樣品，可以用Proteominer的方法，因?yàn)槠溆嗟幕诳贵w的方法都對(duì)蛋白含量有所要求。去掉高豐度蛋白后，我們可以對(duì)尿液先進(jìn)行濃縮，使它的濃度達(dá)到50μg/μL或更高，再進(jìn)行后續(xù)的蛋白提取，效果會(huì)更好。另外，尿液樣品也可以通過(guò)沉淀的方法對(duì)蛋白進(jìn)行提取。

另外，像腦脊液樣品，也可以通過(guò)Proteominer方法進(jìn)行提取，它的蛋白含量也比較低。劉曉慧老師組嘗試過(guò)用安捷倫的特異性去除14個(gè)高豐度蛋白的試劑盒與Proteominer的隨機(jī)去除6個(gè)高豐度蛋白試劑盒進(jìn)行比較，最后能檢測(cè)到的蛋白結(jié)果都差不多。

針對(duì)亞細(xì)胞器的提取，我們分幾步來(lái)完成：

第一步： 對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行勻漿，不需要?jiǎng)虻梅浅Ｋ?，通常勻個(gè)10-20下就可以了；

第二步： 初步分離，使用差速離心的方法，具體說(shuō)明見上圖。

第三步： 用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行再分離。蔗糖密度梯度是連續(xù)的，那么相應(yīng)的亞細(xì)胞器會(huì)在等密度的蔗糖密度區(qū)間內(nèi)沉積。于是，可以將溶酶體、線粒體，以及其它微體分開。然后取出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞器，再進(jìn)行裂解和提取。

第四步： 對(duì)亞細(xì)胞器進(jìn)行驗(yàn)證。這一步需要引入Western，比如用到一些線粒體特異的抗體，或者細(xì)胞膜、細(xì)胞核特異的抗體，進(jìn)行樣品純度的確證，之后再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。否則，如果樣品中有污染，會(huì)給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很難解釋的問(wèn)題。

以上是針對(duì)不同樣品的蛋白提取方法，下一篇將繼續(xù)分享樣品前處理的余下幾步，即蛋白提取的質(zhì)量控制、脫鹽、還原烷基化和酶解。

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理（4）

說(shuō)明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

自從進(jìn)入了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展也朝著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的方向在不斷發(fā)展。

我們知道，在臨床應(yīng)用領(lǐng)域，常常需要用更多的樣品量來(lái)進(jìn)行研究分析，得到更多的結(jié)果。比如，用幾十上百例的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品來(lái)進(jìn)行腫瘤分析。2014年Nature上發(fā)表過(guò)一篇文章，做了95例大腸癌的分析，通過(guò)label free結(jié)果對(duì)95例進(jìn)行分型。與之前的ATGC方法把大腸癌分成四個(gè)型比起來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以更精準(zhǔn)地分成五個(gè)型。這也是蛋白質(zhì)組學(xué)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)很好的應(yīng)用實(shí)例。

（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）

接下來(lái)我們分享兩種新方法，都可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、可重復(fù)且自動(dòng)化的樣品前處理效果。

第一種方法最早發(fā)表于2007年，到今年已經(jīng)成立了一家公司，將這種方法發(fā)展出來(lái)的裝置很好地商業(yè)化了。

當(dāng)時(shí)，整套裝置還需要手工來(lái)組裝。不過(guò)組裝的方法也非常簡(jiǎn)單，根據(jù)上面的圖，分五步走:

第一步:準(zhǔn)備好一張3M的C18過(guò)濾膜，一個(gè)槍頭，一個(gè)平口的針頭和一個(gè)長(zhǎng)手柄；

第二步+第三步：在3M膜上取出一個(gè)小孔的膜，

第四步：將膜捅到EP管里面，用氣把它壓緊了，形成一個(gè)小的膜系統(tǒng)。

第五步：取出手柄和針頭，帶膜的槍頭就完成了。

C18過(guò)濾膜有脫鹽的效果，可以把蛋白質(zhì)或肽段截留在上面，通過(guò)水或BUFFER體系把鹽洗掉，之后再通過(guò)有機(jī)相把肽段或蛋白從C18膜上洗脫下來(lái)。

除了C18膜，還有很多種類型的膜，比如強(qiáng)陽(yáng)離子膜、陰離子膜等。大伙兒看看下面這個(gè)圖，感受一下這些膜的名字和成分。

這里的柱狀圖是對(duì)比不同的膜處理后能鑒定到的肽段的數(shù)量，左圖是肽段水平的鑒定，右圖是蛋白水平的鑒定，差別都不太大（圖里的fr1，2，3是指餾分）。通過(guò)這個(gè)膜系統(tǒng)，可以進(jìn)行分級(jí)分離，也可以進(jìn)行脫鹽。

時(shí)間走到2009年，又出現(xiàn)了一種新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是為了進(jìn)行分級(jí)和富集，而FASP可進(jìn)行酶解（文獻(xiàn)見下圖）。

到了2014年，這個(gè)團(tuán)隊(duì)又將StageTips和FASP方法結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了所有的實(shí)驗(yàn)都在這個(gè)小管子里完成，樣品加入后先清洗，然后還原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下圖的“Reaction chamber”里，然后將肽段通過(guò)下方的膜脫鹽，洗脫，或者直接通過(guò)它進(jìn)行餾分的分離，收集樣品。

四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用這種裝置做下來(lái)，四次都能被重復(fù)的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次單獨(dú)鑒定到的，1.5%是其中兩次鑒定到的，4.0%是其中三次鑒定到的。如果我們考慮到這個(gè)實(shí)驗(yàn)一共鑒定到了9,667個(gè)蛋白（human proteins），在保證了較高的鑒定率的前提下，92.9%的四次重復(fù)率已經(jīng)相當(dāng)不錯(cuò)了！并且信號(hào)強(qiáng)度也比較一致。由于管子體積的限制，這套裝置很適合少量樣品的分析。

該方法已經(jīng)商業(yè)化。2016年Cell Systems上發(fā)表了一篇用這套商業(yè)化的裝置做的血液樣品案例。如下圖，把血液樣品取出來(lái)后，直接加到裝備了膜系統(tǒng)的EP管里。通過(guò)優(yōu)化整個(gè)酶解系統(tǒng)，整個(gè)前處理過(guò)程2個(gè)小時(shí)之內(nèi)就能完成，其中裂解與還原烷基化是同時(shí)完成的。完成之后通過(guò)一個(gè)自動(dòng)化儀器，進(jìn)入質(zhì)譜，經(jīng)過(guò)0.5小時(shí)的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，以及15分鐘的結(jié)果分析，最后鑒定到了300多個(gè)常規(guī)的中高豐度蛋白（這個(gè)例子中沒有對(duì)血液中的高豐度蛋白進(jìn)行去除）。

同樣的，文章里也對(duì)這次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)性評(píng)估，見下圖。

從圖上看，鑒定的重復(fù)性特別好，尤其是49種FDA批準(zhǔn)的Biomarkers中，有41種的CV值都小于20%，說(shuō)明這些biomarkers可以通過(guò)該方法可重復(fù)地檢測(cè)到。這個(gè)方法被認(rèn)為很有希望發(fā)展為高通量樣品處理的方案。

以上是該公司的網(wǎng)址，有興趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的進(jìn)展是，重復(fù)性可以到0.99，樣品處理時(shí)間縮短到了1個(gè)小時(shí)，再加上20分鐘的質(zhì)譜分析，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間得到了很好地控制，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單快速高效且可重復(fù)的要求！我們期待這個(gè)方法能早時(shí)用到臨床樣品的檢測(cè)上。

第二種新方法叫PCT壓力循環(huán)系統(tǒng)。

剛才講到，可以通過(guò)壓力差來(lái)進(jìn)行樣品的破碎和蛋白的提取。另外，我們知道，在高壓條件下，很多反應(yīng)是會(huì)提高效率的，比如說(shuō)酶解、還原烷基化、樣品裂解等。下面這篇文章通過(guò)分析穿刺的樣品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT裝置里，通過(guò)樣品的處理，還原烷基化，酶解，酶解之后脫鹽，取出，直接進(jìn)行SWATH分析。

我們來(lái)看下這種方法的結(jié)果評(píng)估。圖示上方的a 圖表明結(jié)果的SD（樣品標(biāo)準(zhǔn)差）都很小，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果很精確；b圖表明漏切的位點(diǎn)也很少.

圖示下方的a圖表明，可重復(fù)性CV值基本上都小于20%，只有其中兩次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中差異大了一點(diǎn)。

文章里用這個(gè)方法分析了9對(duì)胃癌的癌癥與癌旁組織，然后找到了一組蛋白成為癌癥的潛在標(biāo)志物。

以上是兩種在蛋白質(zhì)臨床檢測(cè)方面非常有前途的方法，都實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、高重現(xiàn)性，自動(dòng)化的處理，感興趣的童鞋可以重點(diǎn)關(guān)注一下。

最后，我們對(duì)整個(gè)第二講的內(nèi)容進(jìn)行一個(gè)小結(jié)，如下圖：

關(guān)于蛋白質(zhì)課前暖場(chǎng)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能說(shuō)課的介紹到此就結(jié)束了，不知道你從中找到你需要的信息了嗎 ？如果你還想了解更多這方面的信息，記得收藏關(guān)注本站。